Сегодня: 14.04.2024
RU / EN
Последнее обновление: 01.03.2024
Мониторинг внутриклеточного рН в стволовых клетках при дифференцировках с использованием флюоресцентной микроскопии и рН-сенсора SypHer-2

Мониторинг внутриклеточного рН в стволовых клетках при дифференцировках с использованием флюоресцентной микроскопии и рН-сенсора SypHer-2

Meleshina A.V., Kashirina A.S., Dudenkova V.V., Vdovina N.V., Cherkasova E.I., Zagaynova E.V.
Ключевые слова: мезенхимные стволовые клетки; дифференцировка; внутриклеточный рН; метаболизм; SypHer-2; флюоресцентная микроскопия.
2018, том 10, номер 1, стр. 93.

Полный текст статьи

pdf
1412
1759

Среди функциональных изменений, сопровождающих процесс дифференцировки стволовых клеток, внутриклеточный рН является одним из важнейших параметров. Концентрация протонов в цитоплазме (внутриклеточный рН) также играет ключевую роль в переключении метаболических путей с окислительного фосфорилирования на аэробный гликолиз. Известно, что щелочной рН сопровождает аэробный глизолиз, а окислительное фосфорилирование в свою очередь сопровождается кислым рН. Для изучения динамики рН в настоящее время отдается предпочтение современным флюоресцентным методам исследования. Методы флюоресцентной микроскопии в сочетании с генетически-кодируемыми сенсорами позволяют неинвазивно исследовать в динамике функциональные изменения, лежащие в основе дифференцировки.

Цель работы — с использованием флюоресцентной микроскопии и рН-сенсора SypHer-2 исследовать динамические изменения рН в мезенхимных стволовых клетках (МСК), подвергающихся дифференцировке в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях.

Материалы и методы. Для индукции адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференцировок применяли коммерческие среды. В качестве флюоресцентного зонда использовали генетически-кодируемый рН-сенсор SypHer-2. Для получения временно трансфицированной линии МСК-SypHer-2 была осуществлена электропорация клеток данным белком. Для перевода условных единиц рН в абсолютные единицы была выполнена калибровка с pH-сенсором SypHer-2. Для генетически кодируемого рН-сенсора SypHer-2, имеющего два пика поглощения, флюоресценцию возбуждали лазером на длине волны 405 нм и аргоновым лазером на длине волны 488 нм для каждого пика, с последующей детекцией в диапазоне 500–550 нм. Полученные изображения обрабатывали с помощью программы Image J (NIH, США). Затем определяли соотношение интенсивностей излучения при возбуждении рН-сенсора на длине волны 488 и 405 нм (I488/I405) для каждого значения рН. В соответствии с калибровочной кривой определяли абсолютные значения рН в недифференцированных МСК и МСК при адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференцировках. Данные об изменениях внутриклеточных значений рН получали на 7, 14 и 21-й дни дифференцировок.

Результаты. Показано закисление внутриклеточного рН при всех дифференцировках МСК (адипогенной, хондрогенной и остео­генной). Описана взаимосвязь изменений динамики внутриклеточного рН и изменений метаболического статуса стволовых клеток, что ранее никем не проводилось. Значения рН у клеток при адипогенной дифференцировке, меньшие по сравнению с другими видами дифференцировок МСК, связаны, по-видимому, с переносом в цитозоль цитрата, необходимого для биосинтеза жирных кислот и с превращением малата в пируват. Относительно высокие значения рН при остеогенной и хондрогенной дифференцировках, по всей вероятности, обеспечивают высокую активность ферментов, катализирующих процесс окисления пролина и лизина в коллагене при участии аскорбиновой кислоты, в частности пролин- и лизингидроксилазы.

Полученные результаты в дальнейшем могут послужить основой для развития эффективных методов оценки дифференцировочных потенций стволовых клеток (в частности, метода оценки внутриклеточного рН как индикатора дифференцировочного статуса клеток), а также стать фундаментом комплексной оценки функциональных изменений в стволовых клеткках человека при направленных дифференцировках на ранних сроках.

  1. Folmes C.D.L., Dzeja P.P., Nelson T.J., Terzic A. Metabolic plasticity in stem cell homeostasis and differentiation. Cell Stem Cell 2012; 11(5): 596–606, https://doi.org/10.1016/j.stem.2012.10.002.
  2. Narae K., Minami N., Yamada M., Imai H. Immobilized pH in culture reveals an optimal condition for somatic cell reprogramming and differentiation of pluripotent stem cells. Reprod Med Biol 2017; 16(1): 58–66, https://doi.org/10.1002/rmb2.12011.
  3. McBrian M.A., Behbahan I.S., Ferrari R., Su T., Huang T-W., Li K., Hong C.S., Christofk H.R., Vogelauer M., Seligson D.B., Kurdistani S.K. Histone acetylation regulates intracellular pH. Mol Cell 2013; 49(2): 310–321, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2012.10.025.
  4. Occhipinti R., Boron W.F. Mathematical modeling of acid-base physiology. Prog Biophys Mol Biol 2015; 117(1): 43–58, https://doi.org/10.1016/j.pbiomolbio.2015.01.003.
  5. Damaghi M., Wojtkowiak J.W., Gillies R.J. pH sensing and regulation in cancer. Front Physiol 2013; 4: 370, https://doi.org/10.3389/fphys.2013.00370.
  6. Gao W., Zhang H., Chang G., Xie Z., Wang H., Ma L., Han Z., Li Q., Pang T. Decreased intracellular pH induced by cariporide differentially contributes to uman umbilical cord-derived mesenchymal stem cells differentiation. Cell Physiol Biochem 2014; 33(1): 185–194, https://doi.org/10.1159/000356661.
  7. Gerweck L.E., Seetharaman K. Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. Cancer Res 1996; 56(6): 1194–1198.
  8. Ailing T., Mantalaris A., Lim M. Influence of culture pH on proliferation and cardiac differentiation of murine embryonic stem cells. Biochemical Engineering Journal 2014; 90: 8–15, https://doi.org/10.1016/j.bej.2014.05.005.
  9. Bryne U., Grillo-Hill B.K., Benitez M., Azimova D.R., Barber D.L., Nystul T.G. Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation. J Cell Biol 2016; 215(3): 345–355, https://doi.org/10.1083/jcb.201606042.
  10. Boussouf A., Gaillard S. Intracellular pH changes during oligodendrocyte differentiation in primary culture. J Neurosci Res 2000; 59(6): 731–739, https://doi.org/10.1002/(sici)1097-4547(20000315)59:6731::aid-jnr53.0.co;2-g.
  11. Kohn D.H., Sarmadi M., Helman J.I., Krebsbach P.H. Effects of pH on human bone marrow stromal cells in vitro: implications for tissue engineering of bone. J Biomed Mater Res 2002; 60(2): 292–299, https://doi.org/10.1002/jbm.10050.
  12. Leem Y.H., Kim J.H., Lee K.S., Lee D.H., Yun J., Chang J.S. The effects of extracellular pH on proliferation and differentiation of human bone marrow stem cells. Korean Journal of Bone Metabolism 2012; 19(1): 35, https://doi.org/10.11005/kjbm.2012.19.1.35.
  13. Calderón Montaño J.M., Burgos Morón E., Pérez Guerrero C., Salvador Bofill F.J., Robles Frías A., López Lázaro M. Role of the Intracellular pH in the metabolic switch between oxidative phosphorylation and aerobic glycolysis — relevance to cancer. WebmedCentral 2011; 2(3): 1–10.
  14. Shum L.C., White N.S., Mills B.N., Bentley K.L., Eliseev R.A. Energy metabolism in mesenchymal stem cells during osteogenic differentiation. Stem Cells Dev 2016; 25(2): 114–122, https://doi.org/10.1089/scd.2015.0193.
  15. Pattappa G., Heywood H.K., de Bruijn J.D., Lee D.A. The metabolism of human mesenchymal stem cells during proliferation and differentiation. J Cell Physiol 2010; 226(10): 2562–2570, https://doi.org/10.1002/jcp.22605.
  16. Han J., Burgess K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev 2010; 110(5): 2709–2728, https://doi.org/10.1021/cr900249z.
  17. Battisti A., Digman M.A., Gratton E., Storti B., Beltram F., Bizzarri R. Intracellular pH measurements made simple by fluorescent protein probes and the phasor approach to fluorescence lifetime imaging. Hem Commun (Camb) 2012; 48(42): 5127–5129, https://doi.org/10.1039/c2cc30373f.
  18. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J.W., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz H.P., Hedrick M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001; 7(2): 211–228, https://doi.org/10.1089/107632701300062859.
  19. Belousov V.V., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Staroverov D.B., Shakhbazov K.S., Terskikh A.V., Lukyanov S. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods 2006; 3(4): 281–286, https://doi.org/10.1038/nmeth866.
  20. Lemasters J.J., Holmuhamedov E. Voltage-dependent anion channel (VDAC) as mitochondrial governator — thinking outside the box. Biochim Biophys Acta 2006; 1762(2): 181–190, https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2005.10.006.
  21. Mannella C.A., Kinnally K.W. Reflections on VDAC as a voltage-gated channel and a mitochondrial regulator. J Bioenerg Biomembr 2008; 40(3): 149–155, https://doi.org/10.1007/s10863-008-9143-0.
  22. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular biology of the cell. New York: Garland Science; 2002.
  23. Trivedi B., Danforth W.H. Effect of pH on the kinetics of frog muscle phosphofructokinase. J Biol Chem 1966; 241(17): 4110–4112.
  24. Erecińska M., Deas J., Silver I.A. The effect of pH on glycolysis and phosphofructokinase activity in cultured cells and synaptosomes. J Neurochem 1995; 65(6): 2765–2772, https://doi.org/10.1046/j.1471-4159.1995.65062765.x.
  25. Fantin V.R., St-Pierre J., Leder P. Attenuation of LDH-A expression uncovers a link between glycolysis, mitochondrial physiology, and tumor maintenance. Cancer Cell 2006; 9: 425–434, https://doi.org/10.1016/j.ccr.2006.04.023.
  26. Huber V., De Milito A., Harguindey S., Reshkin S.J., Wahl M.L., Rauch C., Chiesi A., Pouysségur J., Gatenby R.A., Rivoltini L., Fais S. Proton dynamics in cancer. J Transl Med 2010; 8: 57, https://doi.org/10.1186/1479-5876-8-57.
  27. Varum S., Rodrigues A.S., Moura M.B., Momcilovic O., Easley C.A. 4th, Ramalho-Santos J., Van Houten B., Schatten G. Energy metabolism in human pluripotent stem cells and their differentiated counterparts. PLoS One 2011; 6(6): e20914, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0020914.
  28. Meleshina A.V., Dudenkova V.V., Shirmanova M.V., Bystrova A.S., Zagaynova E.V. Multiphoton fluorescence lifetime imaging of metabolic status in mesenchymal stem cell during adipogenic differentiation. Proc. SPIE 9712, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVI 2016, https://doi.org/10.1117/12.2209056.
  29. Meleshina A.V., Dudenkova V.V., Shirmanova M.V., Shcheslavskiy V.I., Becker W., Bystrova A.S., Cherkasova E.I., Zagaynova E.V. Probing metabolic states of differentiating stem cells using two-photon FLIM. Sci Rep 2016; 6: 21853, https://doi.org/10.1038/srep21853.
  30. Meleshina A.V., Dudenkova V.V., Bystrova A.S., Kuznetsova D.S., Shirmanova M.V., Zagaynova E.V. Two-photon FLIM of NAD(P)H and FAD in mesenchymal stem cells undergoing either osteogenic or chondrogenic differentiation. Stem Cell Res Ther 2017; 8(1): 15, https://doi.org/10.1186/s13287-017-0484-7.
Meleshina A.V., Kashirina A.S., Dudenkova V.V., Vdovina N.V., Cherkasova E.I., Zagaynova E.V. Intracellular pH Monitoring in Stem Cells During Differentiation Using Fluorescence Microscopy and pH-Sensor SypHer-2. Sovremennye tehnologii v medicine 2018; 10(1): 93, https://doi.org/10.17691/stm2018.10.1.12


Журнал базах данных

pubmed_logo.jpg

web_of_science.jpg

scopus.jpg

crossref.jpg

ebsco.jpg

embase.jpg

ulrich.jpg

cyberleninka.jpg

e-library.jpg

lan.jpg

ajd.jpg