Изучение влияния биопокрытия роговицы на основе оригинального гидрогелевого биополимерного скаффолда на структуры переднего отрезка глаза в эксперименте

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения, минимум 2,2 млрд людей страдают нарушением зрения и слепотой, при этом патология роговицы встречается у 4,2 млн человек [1]. В Российской Федерации заболевания роговицы составляют 5,9% всех причин слабовидения и слепоты среди взрослого населения [2].

Этиология поражений роговицы многообразна и включает в себя широкий спектр инфекционных, воспалительных, дистрофических, нейротрофических, аутоиммунных заболеваний, проявлений первичной и вторичной лимбальной недостаточности, а также травмы и ожоги. Многие поверхностные дефекты роговицы поддаются стандартным методам консервативного лечения с благоприятным зрительным исходом. Однако проблема замедленной реэпителизации роговицы остается одной из актуальных в современной офтальмологии и может сопровождаться присоединением вторичной инфекции, изъязвлением и перфорацией роговицы, ее васкуляризацией, формированием стойких помутнений и, как следствие, значительным снижением зрения и слепотой [3–5].

С целью стимуляции и ускорения заживления тканей в различных областях регенеративной медицины, в том числе и в офтальмологии, применяют производные крови в виде тромбоцитарных препаратов, которые стимулируют репаративные процессы в поврежденных тканях и обладают выраженным противовоспалительным эффектом [6–8]. Однако для поддержания концентрации биологически активных веществ на глазной поверхности и достижения стабильного терапевтического эффекта необходимы частые инстилляции препарата.

Множество исследований посвящено применению амниотической мембраны в качестве биологического покрытия роговицы. Трансплантация амниотической мембраны способствует эпителизации дефектов роговицы, поскольку эта мембрана служит базальной мембраной для роста эпителиальных клеток; обеспечивает эпителий факторами роста и цитокинами, стимулируя адгезию и дифференцировку клеток и уменьшая апоптоз кератоцитов [9–12]. Однако данный материал труден в заготовке, требует дорогостоящих обследований доноров на наличие инфекций. Кроме того, он недоступен на отечественном рынке в качестве медицинского продукта.

В последние годы были предложены различные виды биоинженерных конструкций скаффолдов — структур, служащих субстратом и направляющей для восстановления и регенерации тканей. Такие скаффолды обладают высокой биосовместимостью, способны поддерживать высокую концентрацию доставляемых в поврежденные ткани веществ, а также, по сравнению с амниотической мембраной, могут быть стандартизованы в процессе изготовления [13].

Одной из функций скаффолдов является создание среды, имитирующей естественный внеклеточный матрикс (ВКМ). Гидрогелевые скаффолды обладают самоподдерживающейся вязкоупругой сетчатой 3D-структурой и биологической активностью, что позволяет образовывать адгезивные комплексы между клетками и ВКМ. Наличие подобных свойств стало поводом для оценки возможности использования гидрогелевого скаффолда в лечении заболеваний глаз, связанных с длительно существующими незаживающими дефектами роговичной поверхности. Данная тема практически не представлена в литературе, что требует отдельных исследований по оценке безопасности подобного способа лечения.

Цель исследования — изучить влияние био­покрытия роговицы на основе оригинального гидрогелевого биополимерного скаффолда на неповрежденные структуры переднего отрезка глаза и его придаточного аппарата в эксперименте.

Материалы и методы

Экспериментальное исследование проведено на 6 кроликах (6 глаз) породы шиншилла массой тела 2,5–3,0 кг. Работа выполнена в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.).

Объектом изучения было биопокрытие на основе оригинального гидрогелевого биополимерного скаф­фолда. Скаффолд разработан в Приволжском исследовательском медицинском университете [14]. Для формирования скаффолдов использовали композит на основе криопреципитата плазмы крови человека с пэгилироваными белками. К пэгилированному криопреципитату добавляли 2% раствор коллагена (коллаген, выделенный из шкур трески [15]), pH=7,2–7,4. Формирование скаффолда проводили в условиях ферментативного гидролиза. Для полимеризации композита в него добавляли тромбин-кальциевую смесь: 80 МЕ/мл тромбина в 1% растворе CaCl₂. После формирования скаффолды помещали в чашки Петри с физиологическим раствором с целью предотвращения пересыхания гидрогеля. До момента использования скаффолды хранили при температуре 2–8°С.

До начала эксперимента животные были раз­делены на 2 группы: в первой группе использовали скаффолд толщиной 1,5 мм (3 кролика, 3 глаза), во второй — скаффолд толщиной 2,0 мм (3 кролика, 3 глаза). Выбор разной толщины скаффолда был связан с необходимостью оценки скорости его биодеградации на интактной роговичной поверхности. У всех экспериментальных животных до старта исследования офтальмологический статус не был изменен.

Оперативное лечение проводили с соблюдением правил асептики и антисептики в условиях медикаментозного сна с выполнением подкожной инъекции 0,1% раствором атропина сульфата, внутримышечной — раствора Золетила в дозировках, пропорциональных массе тела животного; местно использовали инстилляции Инокаина. После стандартной обработки операционного поля, проведения эпибульбарной анестезии и установки векорасширителя удаляли третье веко. Из гидрогелевого биополимерного скаффолда трепаном выкраивали диск диаметром 10,0 мм и фиксировали его к роговице правого глаза кролика четырьмя узловыми швами нитью Prolene 10-0 для предупреждения смещения (рис. 1). Операцию завершали простой блефарорафией двумя П-образными швами нитью Mersilene 5-0. Левый глаз кролика оставался интактным.

---

Рис. 1. Выкроенный трепаном гидрогелевый биополимерный скаффолд, размещенный на поверхности роговицы

---

В послеоперационном периоде ежедневно проводили инстилляции 0,5% раствором левофлоксацина 2 раза в день в целях профилактики присоединения вторичной инфекции. Ежедневно клинически оценивали выраженность воспалительной реакции со стороны придаточного аппарата и видимых структур переднего отрезка глаза.

На 3, 7 и 9-е сутки от начала эксперимента проводили гистологическую оценку. После вывода животных из эксперимента и экзентерации оперированных глаз полученный материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Выполняли серии гистологических срезов с окраской гематоксилином и эозином. Препараты изучали под микроскопом Leica DM LВ2 (Leica, Германия) при увеличении 50, 100, 200, 400 и 630 с последующей фоторегистрацией на слайдсканере Leica Aperio CS2 (Leica, США).

Результаты

Биомикроскопия. После операции в течение всего периода наблюдения веки оставались спокойными, видимые участки конъюнктивы были бледно-розовыми, роговица и глубжележащие структуры не визуализировались из-за проведенной бле­фарорафии.

На 3-и сутки от начала эксперимента на просматриваемых участках роговицы скаффолд присутствовал в глазах всех экспериментальных животных. На 7-е сутки визуализировалась биодеградация скаффолдов толщиной 1,5 и 2,0 мм и наблюдалось вымывание их фрагментов из конъюнктивальной полости в виде тяжей белого цвета во время закапывания антибиотика. На 9-е сутки эксперимента при осмотре видимых структур переднего отрезка глаза структуры скаффолда не просматривались. По этой причине животные были выведены из эксперимента на 9-е сутки.

Таким образом, за время клинического на­блюдения за глазами экспериментальных животных не было отмечено негативного действия биопокрытия на структуры переднего отрезка глаза и придаточного аппарата. Признаки инфицирования конъюнктивальной полости не наблюдались, гнойное отдаляемое отсутствовало.

Гистологическое исследование. Гистологи­чес­­кое исследование препаратов глаз кроликов на 3-и сутки эксперимента не выявило структурных изменений переднего отрезка глаза на фоне аппликаций скаффолдами толщиной 1,5 и 2,0 мм. Роговица на всем протяжении имела одинаковую толщину, была равномерно эпителизирована, без изменений структуры стромы, десцеметовой мембраны и эндотелия, общая топография ВКМ не была изменена (рис. 2).

---

Рис. 2. Гистологический препарат глаза кроликана 3-е сутки эксперимента, толщина скаффолда 1,5 мм: а — макропрепарат глаза кролика: изменений переднего отрезка не обнаружено; б — роговица эпителизирована равномерно; строма без признаков отека, малоклеточная; десцеметова мембрана и эндотелий без особенностей

---

На 7-е сутки эксперимента гистологические исследования также не выявили структурных изменений переднего отрезка глаза в обеих исследуемых группах (рис. 3).

---

Рис. 3. Гистологический препарат глаза кролика на 7-е сутки эксперимента, толщина скаффолда 1,5 мм (а, б) и 2,0 мм (в, г): а, в — макропрепарат глаза кролика: изменений переднего отрезка не обнаружено; б, г — роговица эпителизирована равномерно; строма без признаков отека, малоклеточная; десцеметова мембрана и эндотелий без особенностей

---

На 9-е сутки эксперимента гистологическое исследование препаратов глаза кроликов со скаффолдом толщиной 1,5 мм не выявило структурных изменений переднего отрезка (рис. 4).

---

Рис. 4. Гистологический препарат глаза кролика на 9-е сутки эксперимента, толщина скаффолда 1,5 мм: а — макропрепарат глаза кролика: изменений переднего отрезка не обнаружено; б–в — роговица эпителизирована равномерно; строма без признаков отека, малоклеточная; десцеметова мембрана и эндотелий без особенностей

---

После гистологической проводки следов скаффолда на глазной поверхности во 2-й группе на 9-е сутки эксперимента не обнаружено, однако отмечены изменения переднего эпителия и передних слоев стромы роговицы. Эпителий роговицы был утолщен за счет увеличения количества его слоев: базальный слой имел признаками псевдорядности, наблюдались признаки гиперплазии слоя крыловидных клеток с увеличением количества слоев до 10. Строма была умеренно отечной с признаками увеличения клеточных элементов в передних слоях; десцеметова мембрана и эндотелий — без особенностей (рис. 5).

---

Рис. 5. Гистологический препарат глаза кролика на 9-е сутки эксперимента, толщина скаффолда 2,0 мм: а — макропрепарат глаза кролика: на поверхности включения отсутствуют; б, в — роговица эпителизирована равномерно; эпителий утолщен за счет увеличения количества слоев; базальный слой с признаками псевдорядности; признаки гиперплазии слоя крыловидных клеток с увеличением количества слоев до 10. Строма умеренно отечная, в передних слоях увеличение клеточных элементов, десцеметова мембрана и эндотелий без особенностей

---

При вырезке материала со скаффолдом толщиной 2,0 мм на поверхности роговой оболочки и в конъюнктивальной полости были обнаружены белые матовые артифициальные скопления — остатки биополимерного материала, подвергшегося биодеградации (рис. 6).

---

Рис. 6. Макрокропрепарат с остатками био­поли­мерного материалав конъюнктивальной полости (указано стрелкой)

---

Обсуждение

Основными структурообразующими белками оригинального гидрогелевого скаффолда являются фибриноген/фибрин и коллаген I типа [16]. Эти адгезивные пептиды могут активировать рецепторы интегринов на поверхности клеток, связываться с белками ВКМ или растворимыми внеклеточными лигандами.

Коллаген I типа является преобладающим коллагеном в большинстве тканей у животных высшего порядка и наиболее часто используется в медицине. Он состоит из двух α1-цепей и одной α2-цепи с диаметром фибрилл 50 нм [17]. В структуре роговицы коллаген I типа составляет 80–90% фибриллярного коллагена кератоцитов [18]. Коллагены являются преимущественным компонентом ВКМ и базальных мембран во всех соединительных тканях, в том числе и в роговице. Кроме этой основной каркасной функции, коллагены способны взаимодействовать со специфическими рецепторами на поверхности клеток, влияя на многочисленные клеточные процессы, включая клеточную адгезию, миграцию, дифференцировку, пролиферацию [19]. Коллагены также участвуют в захвате, хранении и доставке факторов роста и цитокинов, что делает их идеальными для создания систем транспортировки лекарств и факторов роста. Благодаря упомянутым рецепторным взаимодействиям, функциям хранения и доставки, коллаген играет ведущую роль в заживлении ран и регенерации тканей [20]. Коллаген I типа обладает высокой биосовместимостью и способностью к биодеградации под действием эндогенных коллагеназ. Некоторые продукты распада экзогенного коллагена I–III типов вызывают хемотаксис фибробластов человека. В свою очередь подобная деградация способствует восстановлению структуры и функций тканей [21].

Известно, что плазма крови, которая легла в основу представленного композита скаффолда, содержит аминокислоты, необходимые для роста и пролиферации клеток вместе с некоторыми из ключевых белков ВКМ, такими как фибриноген и фибронектин [22]. Фибронектин представляет собой адгезивный гликопротеин, присутствующий в слезной жидкости, базальной мембране эпителия роговицы и конъюнктивы. Он играет важную роль в клеточной миграции, действуя как временная матрица, по которой мигрируют эпителиальные клетки в процессе регенерации дефекта эпителия.

Несколько исследований продемонстрировали способность фибриногена и фибрина, благодаря гепарин-связывающему домену, связывать, длительно удерживать и медленно высвобождать факторы роста различных семейств (PDGF, FGF, TGF-ß) [23, 24]. Эта физиологическая особенность фибриновой матрицы действовать в качестве депо оказывает благоприятное влияние на восстановление поврежденных тканей.

В данном исследовании длительная адгезия эпителия роговицы с поверхностью скаффолда способствовала поддержанию жизнеспособности поверхностных слоев роговицы (уменьшению их слущивания) и выраженной пролиферативной активности базального эпителия с увеличением слоев крыловидных клеток. Подобные эффекты могут во многом определяться сигналами, получаемыми клетками от биологически активного скаффолда, и поддерживаться за счет наличия комплекса белковых факторов, изначально присутствующих в крио­преципитате плазмы крови и высвобождающихся в течение периода биодеградации биополимерной матрицей.

Первый опыт применения гидрогелевого биополимера показал, что через 9 дней после фиксации скаффолда толщиной 1,5 мм на поверхности интактной роговицы отмечалась его полная резорбция. В свою очередь при использовании образца толщиной 2,0 мм имело место сохранение остаточного артифициального материала в сводах конъюнктивальной полости. Скорость резорбции биоматериала в ране во многом может зависеть от действия протеолитических ферментов, выраженности процесса альтерации и воспаления в очаге повреждения. Следует отметить отсутствие признаков инфекционного заражения глазной поверхности и придаточного аппарата глаза в течение всего периода наблюдения за экспериментальными животными (9 дней).

Таким образом, оригинальный гидрогелевый скаффолд на основе криопреципитата плазмы крови и коллагена I типа не оказывает цитотоксического воздействия на интактную поверхность роговицы кролика.

Заключение

Экспериментальное исследование показало, что биопокрытие на основе оригинального гидрогелевого биополимерного скаффолда подвергается самостоятельной биодеградации без последствий для глазного яблока и его придаточного аппарата. Увеличение толщины биопокрытия в эксперименте привело к замедлению биодеградации и частичному сохранению его структур на поверхности глаза вплоть до 9-х суток эксперимента. Этот факт позволил продемонстрировать активность пролиферативных процессов в эпителии и передних слоях стромы, что косвенно свидетельствует о повышении регенераторных свойств роговицы на фоне создания подходящего микроокружения.

Финансирование. Исследование не получило какого-либо конкретного гранта от финансирующих агентств в государственном, коммерческом или некоммерческом секторах.

Конфликт интересов отсутствует.