Том 18 номер 5 (2026)

Введение

Глиобластома — самый распространенный вид нейроэпителиальной опухоли головного мозга у взрос­лых, составляющий 48,6% всех злокачественных новообразований центральной нервной системы [1, 2]. В настоящее время терапия глиобластомы в соответствии со стандартами лечения основана на максимально радикальном хирургическом удалении опухоли с последующей фракционированной лучевой терапией одновременно с адъювантной химиотерапией темозоломидом [3]; в качестве второй линии применяются бевацизумаб, кармустин, ломустин [4, 5]. Медиана выживания при стандартной терапии глиобластомы не превышает 15 мес [2].

Основная гипотеза патогенеза глиобластомы объясняет происхождение опухоли из глиомных стволовых клеток (ГСК), которые в свою очередь образуются из резидентных нейрональных стволовых клеток вследствие онкогенных мутаций и других факторов [6]. ГСК устойчивы к лучевой и химиотерапии, поэтому предполагается, что именно покоящиеся ГСК являются основным фактором рецидива глиобластомы [7–9]. Существует двусторонняя связь между ГСК и иммунными клетками в опухолевом микроокружении (tumor microenvironment, ТME), которая может определять и изменять нишу стволовых клеток для ГСК, а также иммунный состав TME [10]. Таким образом, перспективны комбинированные терапевтические подходы, при которых мишенями являются как высокопролиферативные опухолевые клетки, так и покоящиеся ГСК и иммунные клетки в TME [11, 12].

В качестве альтернативной терапии солидных опухолей рассматривают различные методы иммунотерапии: молекулярно-таргетированную терапию, применение Т-клеток с химерным антигенным рецептором (CAR-T), терапию естественными киллерами (NK-клетками), блокаду иммунных контрольных точек PD-1/PD-L1, противоопухолевые неоантигенные пептидные и мРНК-вакцины, онколитическую виротерапию [13–16]. Применение этих подходов при глио­бластоме пока не принесло значительного успеха вследствие высокой генетической гетерогенности глиобластомы, возникающей в результате ее клональ­ной эволюции [17], а также статуса иммунологически «холодной» опухоли, т.е. опухоли с низкой иммуногенностью и высоким уровнем иммуносупрессии в TME [18]. В связи с этим особую актуальность приобретают подходы по иммунологическому «разогреву» глиобластомы и преодолению иммуносупрессивного влияния TME.

Принципы онколитической терапии основаны на уникальной способности некоторых рекомбинантных вирусов (например, модифицированного вируса простого герпеса, парвовируса, вируса везикулярного стоматита, реовируса, вируса болезни Ньюкасла, вируса лихорадки Рифт-Валли, вируса Синдбис, полио­вируса, вируса Сенека, миксовируса, аденовируса, вируса осповакцины) реплицироваться селективно в опухолевых клетках, вызывать их цитолиз и высвобождение опухолеспецифических антигенов. Это в свою очередь вызывает иммунный ответ в TME и приводит к иммуногенной гибели опухолевых клеток [19]. Кроме того, генетически модифицированные вирусы, нацеленные на опухоли, могут использоваться для селективной «доставки генов» в опухоль. В качестве таких трансгенов могут доставляться иммуномодулирующие вещества, например хемокины (CCL3, CCL5) или интерлейкины (IL-15, IL-21 и др.), для усиления противоопухолевого иммунного ответа в микроокружении опухоли [20–22].

Онколитическая виротерапия с помощью рекомбинантных вирусов осповакцины может применяться как в качестве монотерапии, так и в сочетании с клеточной иммунотерапией или ингибиторами контрольных точек иммунитета [23–25]. В частности, обнадеживающие результаты показала терапия экспериментальной глиомы рекомбинантным вирусом осповакцины, содержащим кДНК IL-21, в сочетании с ингибированием иммунных контрольных точек [21]. Другие доклинические исследования рекомбинантных онколитических вирусов также позволяют рекомендовать этот подход для клинических испытаний при глиобластоме [16, 22, 26, 27].

Ранее в рамках совместной работы нескольких исследовательских групп были разработаны новые рекомбинантные векторы вируса осповакцины (recombinant vaccinia virus, rVV) на основе штамма Листера из Института вирусологических препаратов (Lister strain from the Institute of Viral Preparations, LIVP) с дефектной тимидинкиназой, содержащие кДНК IL-15. Эффективность полученного рекомбинантного штамма LIVP-mIL15 была показана в экспериментах на моделях рака толстой кишки и рака молочной железы у мышей [28]. Поскольку известно, что глиобластома восприимчива к rVV, данное исследование является логическим продолжением наших предыдущих работ.

Цель исследования — изучить влияние рекомбинантного штамма вируса осповакцины, несущего кДНК интерлейкина 15 (LIVP-mIL15), на опухолевое микроокружение экспериментальной глиомы GL261.

Материалы и методы

Вирусы. Рекомбинантный штамм вируса осповакцины (LIVP-mIL15) с делецией тимидинкиназы был создан на основе штамма LIVP исследовательской группой под руководством академика РАН П.М. Чумакова в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН [27, 28]. Для отслеживания адресной доставки целевого белка (IL-15 мыши) к опухолям были сконструированы штаммы LIVP, дополнительно экспрессирующие репортерный ген красного флуоресцентного белка tagRFP (Red Fluorescent Protein) под контролем промотора 7,5 К (LIVP-mIL15-RFP), либо ген люциферазы светлячка FLuc (firefly luciferase) (LIVP-mIL15-FLuc), которые были успешно протестированы в предыдущих исследованиях [28, 29]. Все рекомбинантные вирусы были очищены методом центрифугирования в градиенте сахарозы для экспериментов invitro и invivo. Титры вирусов определяли, как описано ранее [28].

Культивирование клеточных линий и моделирование сфероидов глиобластомы. Клетки линии GL261 и субклона GL261-GFP (стабильно трансдуцированы лентивирусом с кДНК GFP (green fluorescent protein)) культивировали в модифицированной среде Игла Дульбекко с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (fetal bovine serum, FBS) при 37°C, 5% CO₂ во влажной среде и пересевали каждые 2–3 дня.

Сфероиды клеток мышиной глиобластомы GL261 формировали на 96-луночных планшетах с круглым дном и низкой адгезией (Ultra Low Cluster, 96 лунок, с крышкой; CoStar Group, США). В каждую лунку засевали 3000 клеток. На 3-й день после формирования сфероидов в лунки добавляли рекомбинантный вирус осповакцины (LIVP-mIL15-RFP) в нескольких последовательных разведениях в культуральной среде.

Из каждой лунки отбирали по 100 мкл кондиционированной среды и сразу вносили по 100 мкл свежей питательной среды с кратным разведением вирусных частиц от 10 до 0,3 мкл с титром вируса 2·10⁸ бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл. Таким образом, максимальная доза на один сфероид составляла 2·10⁶ БОЕ при добавлении 10 мкл вирусного препарата к 90 мкл среды.

Сборку и пролиферацию сфероидов наблюдали с помощью системы визуализации Invitrogen EVOS M7000 (Thermo Fisher Scientific, США) в течение 6 сут (около 144 ч).

Исследование на животных. Эксперименты на животных проводились в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006). Протоколы экспериментов одобрены локальным этическим комитетом (ЛЭК) ФНКЦ ФМБА России (протокол №7 от 6.09.2022), ЛЭК ИМБ РАН (протокол №1 от 03.04.2024), ЛЭК РНИМУ им. Н.И. Пирогова (протокол №27/2025 от 24.07.2025). Все животные имели свободный доступ к пище и воде и содержались в условиях контролируемой температуры и влажности.

Моделирование ортотопической глиомы. Cингенную глиому моделировали на 20 мышах линии C57BL/6 (самки). Для имплантации в головной мозг мышей готовили аликвоты клеток GL261 в количестве 150·10³ кл. в 5 мкл стерильного фосфатно-буферного раствора Дульбекко (Dulbecco’s phosphate-buffered saline, DPBS). В условиях экспериментальной операционной мышей с предварительной газовой седацией изофлураном анестезировали Золетилом
(40 мг/кг, 50 мкл; Virbac SA, Франция) и Рометаром (10 мг/кг, 50 мкл; Bioveta, Чехия) и в стадии глубокого наркоза помещали в стереотаксическую систему RWD Life Science (Китай).

Оценка иммунного статуса и прижизненная визуализация. Для оценки иммунного статуса методом проточной цитометрии проводили стереотаксическую инъекцию 150·10³ немеченых клеток GL261 в 5 мкл стерильного DPBS в стриатум правого полушария головного мозга (n=10). Для прижизненной визуализации методом конфокальной микроскопии мышам имплантировали клетки линии GL261-GFP в количестве 150·10³ кл. в 5 мкл стерильного DPBS в кору правого полушария (n=10). Протокол моделирования и стерео­таксические координаты имплантации подробно изложены в нашей предыдущей работе [30].

Магнитно-резонансная томография (МРТ). В Центре коллективного пользования «Медицинские и биотехнологические нанотехнологии» Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова мышам с ортотопической глиомой проводили еженедельное МРТ-исследование на приборе ClinScan 7T (Bruker Biospin, Германия). Протокол МРТ был следующим:

T2-взвешенные изображения в аксиальной плоскости (импульсная последовательность Turbo Spin Echo с импульсом восстановления намагниченности и респираторным триггером; турбо-фактор — 14; усреднения — 2; TR/TE — 3500/46 мс; спектральное подавление жира; поле зрения — 20×45 мм; толщина среза — 0,5 мм; размер матрицы — 130×192);

T2-взвешенные изображения в корональной плоскости (импульсная последовательность Turbo Spin Echo с импульсом восстановления намагниченности и респираторным триггером; турбо-фактор — 18; усреднения — 2; TR/TE — 2500/46 мс; спектральное подавление жира; поле зрения — 15×20 мм; толщина среза — 0,5 мм; размер матрицы — 130×192);

SWI-изображение, взвешенное по магнитной восприимчивости, в аксиальной плоскости (импульсная последовательность 3D Gradient Echo с подавлением радиочастотного сигнала и компенсацией потока; TR/TE — 33/8 мс; угол поворота — 14; усреднения — 1; поле зрения — 20×20 мм; толщина среза — 0,5 мм; размер матрицы — 192×159).

Введение рекомбинантного штамма осповакцины. Однократное введение рекомбинантного штамма после подтверждения опухолевого роста методом МРТ проводили на 5-е (проточная цитометрия) или 10-е сутки (прижизненная визуализация). Животные были случайным образом распределены на 3 группы, которым вводили LIVP-mIL15-RFP, или LIVP-mIL15-FLuc, или 100 мкл DPBS. На одну инъекцию использовали 2,5·10⁵ БОЕ вирусов осповакцины в 100 мкл DPBS. Введение рекомбинантного штамма вируса осповакцины проводили в Национальном научно-исследовательском центре эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Биолюминесцентная визуализация in vivo. Прижизненную биолюминесцентную визуализацию проводили на приборе IVIS-Spectrum СТ (Perkin Elmer, США) в соответствии с инструкциями производителя. Во время выполнения исследования мыши были анестезированы 2,5% изофлураном в кислороде. Для анализа времени адресной доставки LIVP-mIL15-FLuc вводили внутривенно и стереотаксически. Сигнал биолюминесценции от рекомбинантного штамма вируса осповакцины, содержащего биолюминесцентную метку FLuc, регистрировали через 15 мин после внутрибрюшинного введения натриевой соли D-люциферина (BioVision, США) в дозе 150 мг/кг. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения LivingImage 4.2 (Caliper Life Sciences, США). Сигнал биолюминесценции оценивали количественно, используя суммарные значения излучения в области интереса, вручную выделенной для обозначения всей сигнальной области опухоли головного мозга.

Прижизненная конфокальная микроскопия. Интравитальную микроскопию у мышей с ортотопической глиомой GL261-GFP проводили через 48 ч после стереотаксического внутриопухолевого введения LIVP-mIL15-RFP. Исследование выполняли на инвертированном конфокальном микроскопе Nikon A1 (Nikon, Япония) со специальным кастомизированным столиком, позволяющим фиксировать животное. За час до исследования мышам внутривенно вводили первичные флуоресцентно меченые антитела к поверхностным рецепторам лимфоцитов (anti-mouse CD45 Brilliant Violet 421; 103134; BioLegend, США).

Под глубоким наркозом голову мыши фиксировали в стереотаксической рамке (RWD) и в стерильных условиях формировали внутричерепное окно над очагом глиомы, без вскрытия мягкой мозговой оболочки. Затем мышь фиксировали на подогретом кастомизированном столике так, чтобы опухоль находилась непосредственно над объективом. Процедура визуализации занимала ~15–20 мин. После завершения эксперимента мышей декапитировали, головной мозг извлекали для исследования exvivo.

Анализ колокализации проводили следующим образом. С помощью программы NIS Elements AR (Nikon, Япония) были выбраны репрезентативные области изображения опухоли с флуоресцентными сигналами как от клеток, инфицированных LIVP-mIL15-RFP, так и от клеток GL261-GFP, с применением бинарной маски. Порог для выбора был установлен на минимальном уровне, позволяющем удалить фоновый шум. Затем был проведен анализ колокализации сигналов от CD45, LIVP-mIL15-RFP и GL261-GFP в выбранных зонах. Для оценки колокализации использовали коэффициент перекрытия Мандерса, поскольку он менее чувствителен к вариациям интенсивности сигнала и влиянию фонового шума. Для обеспечения статистической достоверности данных было проанализировано не менее 15 полей зрения. Изображения конфокальной микроскопии обрабатывали с помощью программного обеспечения NIS Elements AR (Nikon, Япония).

Проточная цитометрия. Свежевыделенный головной мозг мышей измельчали в культуральной среде RPMI c помощью диссоциатора тканей DSC-400 RWD Life Science (Китай) согласно протоколу производителя. Для получения суспензии отдельных клеток ткань пропускали через сито с размером ячейки 100 мкм, затем через сито с размером ячейки 70 мкм. Клетки промывали в DPBS, разбавляли до концентрации 1^–5·10⁶/мл в холодном буфере DPBS, дополненном 10% FBS. Клетки инкубировали при 4°C в течение 20 мин с выбранными антителами против CD45 (кат. №103134, №103116), CD3 (кат. №100209), CD4 (кат. №100407), CD8 (кат. №100753), CD19 (кат. №115549), NK1.1 (кат. №108741), CD11b (кат. №101208), CD11c (кат. №117312), Ly6G (кат. №127626), F4/80 (кат. №123110) от BioLegend (США) в DPBS, дополненном 2% FBS, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,1% азида натрия (буфер для промывки). Затем клетки дважды промывали промывочным буфером, ресуспендировали в том же буфере, центрифугировали при 300 g в течение 10 мин и переносили в 96-луночный планшет для последующего анализа. Анализ методом проточной цитометрии проводили на анализаторе MACSQuant Analyzer 16 (Miltenyi Biotec, Германия) с использованием программного обеспечения FlowJo. Исследование выполняли через 48 ч после однократного стерео­таксического введения LIVP-mIL15-RFP.

Статистическая обработка данных. Для статистического анализа использовали программное обеспечение GraphPad Prism v. 8.0.2 (GraphPad Software, Inc., США). Данные представляли в виде медианы (Me), первого и третьего квартиля [Q1; Q3], минимального и максимального значений (min, max). При оценке достоверности различий применяли непараметрические критерии для малых выборок. Для данных с нормальным распределением (счет фотонов) результат представляли как среднее значение (Mean) ± стандартное отклонение (SD). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

In vitro исследование на модели опухолевых сфероидов GL261. При использовании invitro LIVP-mIL15-RFP эффективно инфицировал клетки GL261 в 3D-сфероидах, что детектировалось по экспрессии RFP (рис. 1). Появление красной флуоресценции в целевых клетках, подвергнутых воздействию LIVP-mIL15-RFP, регистрировали с 48–72 до 144 ч. Данные оценивали качественно. Максимально яркий уровень свечения RFP в опухолевых сфероидах наблюдался в диапазоне дозировок от 1,2·10⁵ до 2,5·10⁵ БОЕ на сфероид. При добавлении 5·10⁵ БОЕ уровень экспрессии начинал заметно снижаться вследствие цитопатического эффекта. При добавлении максимальной дозы (10 мкл, 2·10⁶ БОЕ вируса) с самого начала наблюдался выраженный цитопатический эффект, приводящий к полной дезинтеграции сфероида после 96 ч наблюдения (см. рис. 1).

Рис. 1. Инфицирование опухолевых сфероидов из клеток линии GL261 рекомбинантным штаммом осповакцины LIVP-mIL15-RFP. Флуоресцентные изображения RFP в инфицированных клетках. Максимальный уровень экспрессии RFP наблюдался в дни 4 и 5 (обозначено стрелками). Титр вирусного препарата 2·10⁸ БОЕ/мл

На основании результатов экспериментов invitro была выбрана доза LIVP-mIL15-RFP 2,5·10⁵ БОЕ (в пересчете на начальное количество 150·10³ имплантируемых клеток глиомы), которая не вызывает быстрой цитотоксической реакции, но является оптимальной с точки зрения способности инфицировать клетки хозяина и приводить к максимальной экспрессии целевого белка.

Внутривенное и стереотаксическое однократное введение рекомбинантного вируса осповакцины мышам с ортотопической глиомой. После имплантации мышам клеток GL261 проводили МРТ-сканирование каждые 5–7 дней в течение 21–22 дней. Объем опухоли к 3-й неделе по данным МРТ достигал 15 мм³ (рис. 2).

Рис. 2. МРТ-визуализация опухоли: а — клетки GL261 были введены в правый стриатум самок мышей линии C57BL/6; МРТ проводили на 1, 2 и 3-й неделе после имплантации опухоли; показаны репрезентативные изображения: верхний ряд — фронтальная проекция, нижний ряд — сагиттальная проекция; стрелками указана локализация опухоли в ткани; б — динамика объема имплантированной опухоли (данные представлены в виде Me [Q1; Q3], min, max)

После подтверждения по данным МРТ опухолевого роста глиомы на 5-й день после имплантации мышам вводили рекомбинантный штамм осповакцины LIVP-mIL15-FLuc и оценивали инфицирование по экспрессии люциферазы с помощью системы оптической визуализации IVIS-Spectrum СТ (Perkin Elmer, США) (рис. 3).

Рис. 3. Внутривенная и стереотаксическая доставка рекомбинантного штамма вируса осповакцины. Клетки GL261 были инокулированы в правый стриатум самок мышей линии C57BL/6. Детекцию биолюминесценции LIVP-mIL15-FLuc осуществляли с помощью IVIS-Spectrum СT через 15 мин после инъекции люциферина. Сигнал наблюдали с помощью системы прижизненной визуализации. Показаны репрезентативные изображения: a — мышь, которой внутривенно вводили LIVP-mIL15-FLuc (слева) или DPBS (справа) через 24 ч после инъекции; б — те же мыши через 144 ч после инъекции; в — мышь, которой стереотаксически вводили LIVP-mIL15-FLuc через 48 ч после инъекции. На графике (г) — динамика внутричерепной люминесценции клеток GL261, инфицированных LIVP-mIL15-FLuc, после внутривенной инъекции (Mean±SD)

После стереотаксического введения LIVP-mIL15-FLuc биолюминесценция детектировалась в области ортотопической глиомы через 48 ч после инъекции и интенсивность ее увеличивалась вплоть до 6-го дня, что свидетельствовало об активной экспрессии целевого белка опухолевыми клетками после инфицирования LIVP-mIL15-FLuc (рис. 3, в).

В случае внутривенного введения LIVP-mIL15-FLuc биолюминесценция в области ортотопической глиобластомы была обнаружена через 72 ч после инъекции. Сильный сигнал примерно той же интенсивности наблюдался в течение 6 дней (144 ч) после введения LIVP-mIL15-FLuc (рис. 3, г). Таким образом, LIVP-mIL15-FLuc, введенный и внутривенно, и стерео­таксически, инфицировал опухолевые клетки и приводил к экспрессии ими целевого белка.

Прижизненная конфокальная микроскопия LIVP-mIL15-RFP in vivo. Исследование доставки LIVP-mIL15-RFP в опухоль и периглиомную зону проводили методом прижизненной конфокальной микроскопии. Инфицированные клетки глиомы и периглиомной зоны детектировали по флуоресценции RFP, а природу инфицированных клеток определяли по колокализации сигнала от RFP с другими репортерными сигналами. На основании результатов, предварительно полученных с помощью оптической визуализации IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, США), исследование адресной доставки LIVP-mIL15-RFP с клетками глиобластомы и периглиомной зоны было проведено через 48 ч после введения LIVP-mIL15-RFP. Через транскраниальное окно одновременно детектировали флуоресцентные сигналы синего, зеленого и красного каналов: BV421 (CD45⁺ клетки TME), GFP (клетки GL261) и RFP (рекомбинантный штамм осповакцины LIVP-mIL15-RFP). Для оценки того, какие клетки, GL261 или CD45⁺, преимущественно являются мишенями для LIVP-mIL15-RFP после cтереотаксического введения, был проведен анализ колокализации сигналов (рис. 4).

Рис. 4. Результаты интравитальной микроскопии при стереотаксическом введении LIVP-mIL15-RFP в очаг ортотопической глиомы GL261-GFP: а, б — визуализируется экспрессия RFP как в инфицированных опухолевых клетках, так и в клетках TME; стрелкой показан очаг ортотопической глиомы GL261-GFP; некоторое количество инфицированных RFP⁺ клеток наблюдается по ходу трека от стереотаксического введения вируса; флуоресценция в синем канале (anti-CD45-BV421) показывает присутствие лейкоцитов/иммунных клеток в микроокружении опухоли; в, г — колокализационный анализ сигнала RFP и сигналов от GL261-GFP и anti-CD45-BV421; наибольшая степень колокализации показана для RFP и GFP, однако также имеется субпопуляция клеток CD45⁺RFP⁺ (т.е. часть лейкоцитов/иммунных клеток ТМЕ также инфицируются LIVP-mIL15-RFP)

Согласно обработанным результатам, бόльшая часть сигналов инфицирования LIVP-mIL15-RFP колокализовалась с клетками глиомы GL261. Кроме того, наблюдалась субпопуляция CD45⁺ иммунных клеток TME, в которых также колокализовался сигнал от LIVP-mIL15-RFP (рис. 4, г). Эти данные свидетельствуют об ограниченной селективности LIVP-mIL15-RFP по отношению к клеткам опухоли.

Исследование микроокружения экспериментальной глиомы после однократного введения LIVP-mIL15-RFP. Субпопуляционный состав иммунных клеток в очаге экспериментальной глиомы исследовали методом проточной цитометрии спустя 48 ч после однократного стереотаксического введения LIVP-mIL15-RFP. Были сформированы две группы по 10 мышей с 5-дневной подтвержденной на МРТ глиомой. Мышам первой группы вводили LIVP-mIL15-RFP, второй — DPBS (контроль). Внутренним контролем для каждого животного был препарат левого (интактного) полушария.

Исследование методом проточной цитометрии показало, что общая доля CD45⁺ лейкоцитов спустя 48 ч после инъекции LIVP-mIL15-RFP не только не увеличивается, но имеется тенденция к снижению доли CD45⁺ клеток после инъекции вируса как в интактном, так и в пораженном опухолью полушарии (рис. 5, а). Анализ субпопуляционного состава лимфоцитов TME при этом выявил, что после стереотаксической инъекции LIVP-mIL15-RFP в ипсилатеральном (пораженном) полушарии значимо по сравнению с контролем увеличивается доля CD45⁺NK1.1⁺ клеток (натуральные киллеры) и CD45⁺CD8⁺ лимфоцитов (цитотоксические клетки) (рис. 5, б, в). Примечательно, что доля субпопуляций CD45⁺CD4⁺ (хелперы, T-реги) и CD45⁺CD49b⁺ (NK, NKT, цитотоксические лимфоциты) увеличивалась симметрично как в интактном, так и в опухолевом полушарии мозга (рис. 5, г, д). Суммарно полученные данные свидетельствуют о том, что при однократном стереотаксическом введении LIVP-mIL15-RFP через 48 ч наблюдается эффект активации иммунных клеток, в частности натуральных киллеров и цитотоксических лимфоцитов в ТМЕ.

Рис. 5. Субпопуляционный состав CD45⁺ иммунных клеток в интактном и пораженном опухолью полушарии мозга через 48 ч после стереотаксической инъекции LIVP-mIL15-RFP. Анализ методом проточной цитометрии: а — общая популяция CD45⁺ клеток; б — субпопуляция CD45⁺NK1.1⁺ клеток (натуральные киллеры); в — субпопуляция CD45⁺CD8⁺ клеток (цитотоксические лимфоциты); г — субпопуляция CD45⁺CD4⁺ клеток (хелперы); д — субпопуляция CD45⁺CD49b⁺ клеток (NK, NKT и цитотоксические лимфоциты)

Обсуждение

Рекомбинантные онколитические вирусы, способные доставлять в глиомные клетки и клетки микро­окружения опухоли кДНК иммуномодулирующих белков, рассматриваются как перспективные агенты для иммунологического «разогрева» солидных опухолей [27, 29]. В данной работе мы исследовали перспективы расширения спектра применения рекомбинантного штамма LIVP-mIL15-RFP, вызывающего экспрессию IL-15 инфицированными клетками и показавшего эффективность на моделях рака толстой кишки и молочной железы [28]. С учетом своей иммунологической «холодности» экспериментальная глиобластома представляется перспективной мишенью для IL-15, который может активировать рекрутирование NK-клеток и цитотоксических лимфоцитов в TME [30].

Модель на основе клеточной линии GL261 была выбрана как наиболее релевантная экспериментальная глиобластома мыши. Клетки GL261 содержат точечные мутации в генах TP53 и KRAS (кодирующих белки p53 и K-RAS соответственно) [31]. Они устойчивы к лучевой терапии, относительно иммуногенны, экспрессируют главный комплекс гистосовместимости I (MHC I) и имеют относительно высокую нагрузку неоантигенами [32]. Примечательно, что наиболее часто поражаемыми путями в человеческой глиобластоме являются пути p53, RB и RTK/RAS/PI(3)K [33], соответственно можно утверждать, что клеточные модели GL261 в некоторой степени имитируют патогенез человеческой глиобластомы [34].

Продемонстрировано, что LIVP-mIL15-RFP способен инфицировать клетки мышиной глиомы GL261, культивируемые в формате 3D-сфероидов. В условиях invivo LIVP-mIL15-RFP также успешно инфицирует и приводит к экспрессии репортерных генов в клетках ортотопической экспериментальной глиобластомы. Ранее было показано, что rVV стимулируют миграцию инфицированных клеток и таким образом усиливают собственное распространение [35].

Наши данные, показывающие, что внутривенно вводимый LIVP может преодолевать гематоэнцефалический барьер в зоне опухоли и достигать клеток интракраниальной глиомы, демонстрируют его потенциал для системного введения. Это важно, поскольку экзогенный IL-15 при системном или подкожном введении проявляет токсические эффекты [36, 37], а его таргетная доставка к опухоли с помощью rVV может быть более безопасным вариантом.

Известно, что вирусы осповакцины посредством белка VCP (vaccinia virus complement-control protein) могут подавлять систему комплемента, тем самым частично избегая иммунного надзора хозяина в кровотоке [38]. Более того, связанные с опухолью кровеносные сосуды обычно характеризуются повышенной проницаемостью [39], что облегчает проникновение в опухолевую ткань довольно крупных рекомбинантных вирусов осповакцины при внутривенном введении.

Ранее сообщалось, что глиальные клетки головного мозга также могут быть восприимчивы к инфекции rVV без поддержания активной репликации вируса, поэтому неопухолевые микроглиальные клетки и астроциты могут стать «ловушками rVV» (клетками, накапливающими вирус, но ограничивающими его распространение) [40]. Более того, восприимчивость глиальных клеток к rVV, по-видимому, модулируется их фенотипом/состоянием активации. Например, фенотип M2 моноцитарных макрофагов (так называемый проопухолевый фенотип, характерный для макрофагов в TME) более благоприятен для репликации вируса по сравнению с «противоопухолевым» фенотипом M1 [40]. Мы проверили invivo, нацелен ли штамм LIVP-mIL15-RFP преимущественно на клетки глиобластомы или распределяется также и в глиальные клетки. Хотя краевая субпопуляция глиальных клеток вблизи опухолевой ткани также была инфицирована, LIVP-mIL15-RFP в основном обнаруживались внутри опухолевой массы, о чем свидетельствовала колокализация сигналов RFP и GFP при интравитальной микроскопии. Ранее было показано, что CD45⁺ нейтрофилы способны накапливать вирусы [41, 42]. Можно предположить, что обнаруженная нами колокализация репортерных сигналов и CD45 также обусловлена активным захватом rVV нейтрофилами.

Вирус осповакцины имеет двухцепочечный ДНК-геном (дцДНК); его репликация происходит в цитоплазме. Поэтому при попадании рекомбинантного вируса осповакцины в клетку активируются цитозольные пути распознавания дцДНК клетки-хозяина [43–45]. В свою очередь это приводит к высвобождению интерферонов типа I (IFN-I) и других сигнальных молекул, а также запускает врожденный противовирусный ответ. Первой линией в микроокружении опухоли является привлечение NK-клеток, подгруппы эффекторных лимфоцитов, играющих ключевую роль во врожденном иммунитете. Эти клетки распознают и элиминируют злокачественные и инфицированные вирусами клетки. Примечательно, что NK-клетки, по-видимому, преимущественно уничтожают стволовые клетки глиобластомы (или стволовые клетки глиобластомы более чувствительны к лизису клеток, опосредованному NK-клетками) [46, 47]. Ведущая роль NK-клеток во врожденном иммунном ответе на опухоль головного мозга подробно рассмотрена в [48], однако иммунотерапия с помощью NK-клеток имеет свои ограничения. В микроокружении опухоли NK-клетки способны секретировать иммуномодулирующие молекулы (IFN-γ, CCL4, TNF-α), которые регулируют привлечение и фенотип многих других типов иммунных клеток. В свою очередь, как суммировано в [49], микроокружение опухоли также регулирует фенотип и функции NK-клеток, что может объяснить ограниченный успех терапии NK-клетками против солидных опухолей. Помимо реагирования на вирусную инфекцию и выполнения функции иммуномодулирующих клеток, NK-клетки также являются перспективным типом иммунных клеток для разработки противо­опухолевой терапии на основе химерных антигенных рецепторов (CAR) [50].

Данные о времени привлечения NK-клеток в микроокружение глиобластомы, вызванного однократной дозой рекомбинантного вируса, практически отсутствуют. В наших экспериментах наблюдалось заметное повышение субпопуляции NK-клеток в TME через 48 ч после однократной инъекции LIVP-mIL15-RFP, что, вероятно, было обусловлено экспрессией IL-15-клетками, зараженными LIVP-mIL15. Ранее было показано, что NK-клетки способны создавать субпопуляции «клеток памяти», в связи с этим второй раунд инъекции rVV может вызвать еще более выраженный ответ NK-клеток [51].

IL-15 — цитокин, который регулирует дифференцировку, активацию и выживание NK-клеток [52, 53], поэтому усиление LIVP с помощью кДНК IL-15 представляется нам перспективным подходом для модуляции противоопухолевого NK-клеточного ответа.

Заключение

Рекомбинантный вирус осповакцины LIVP-mIL15-RFP способен инфицировать клетки глиомы GL261 в опухолевых сфероидах, а также клетки интракраниальной глиомы invivo как при стереотаксическом, так и при внутривенном способе введения. Инфекция LIVP-mIL15-RFP, не вызывая видимой массовой гибели опухолевых клеток, оказывает влияние на иммунный состав микроокружения опухоли, увеличивая инфильтрацию CD4⁺, CD8⁺ и NK-клетками, что может положительно влиять на противоопухолевый клеточный иммунитет.

Благодарности. Авторы выражают благодарность Алексею Степаненко за предоставление клеток мышиной глиобластомы линии GL261 (отдел нейробиологии Национального медицинского исследовательского центра психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского, Москва).

Финансирование. Данное исследование было профинансировано грантом Российского научного фонда (№22–64-00057) и государственным заданием ФМБА России.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.