Том 18 номер 5 (2026)

Введение

Акридины (в частности, производное амсакрин, который применяется для лечения острого лейкоза) — это гетероциклы, состоящие из двух колец, соединенных с центральным пиридиновым кольцом. Плоская структура соединений данной группы позволяет им вмешиваться в различные метаболические процессы, в том числе встраиваться между парами оснований ДНК, ингибировать топоизомеразы, теломеразу и протеинкиназы [1], что обусловливает эффективность их применения в качестве потенциальных противоопухолевых агентов. 1,2,3-триазольное кольцо привлекло внимание исследователей благодаря высокому дипольному моменту, метаболической стабильности и способности образовывать водородные связи [2].

При исследовании взаимосвязи между структурой и активностью производных аза-акридина и тетрациклических акридонов было установлено, что оптимальный противоопухолевый эффект наблюдается при наличии боковых цепей, состоящих из двух или трех метиленовых звеньев, в то время как структурные модификации боковых цепей, снижающие способность аминогруппы образовывать водородные связи, заметно ослабляют противоопухолевую эффективность. Введение карбонильной группы между аминогруппой боковой цепи и хромофором повышает гибкость и пространственную упорядоченность целевых молекул, а добавление конденсированной пиразольной группы дополнительно усиливает противоопухолевое действие соединений [3, 4].

Так, производное имидазоакридинона C-1311 продемонстрировало противоопухолевую активность как на экспериментальных моделях мышиного и человеческого колоректального рака in vitro [5], так и в ходе клинических испытаний II фазы у пациенток с метастатическим раком молочной железы [6, 7].

Высокая потенциальная активность C-1311 в отношении рака мочевого пузыря первоначально была предсказана с использованием биоинформатического подхода COXEN. В ходе генетического анализа установлено: C-1311 и паклитаксел воздействуют на клеточные процессы дрожжей с помощью различных неперекрывающихся механизмов, что позволило предположить их синергическое действие при комбинированном применении. На модели рака мочевого пузыря комбинация C-1311 с паклитакселом позволила достичь максимального подавления роста опухолевых клеток при использовании более низких доз препаратов по сравнению с монотерапией каждым из агентов [8].

При изучении биохимических механизмов C-1311 было показано, что соединение интеркалирует в ДНК, ингибирует активность топоизомеразы II, снижает ангиогенез опухоли за счет подавления пути, индуцируемого гипоксией фактора-1α (HIF-1α)/фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [9], и ингибирует FMS-подобную тирозинкиназу 3 с внутренними тандемными дупликациями (FLT3-ITD) [10].

Противоопухолевый потенциал спиро-акридиновых соединений связан с антиангиогенным действием 9-аминоакридинов и усилением реакций Th1-типа, главным образом за счет повышения уровня TNF-α и IL-1β в микроокружении опухоли [11]. Производные акридин-8-онов ингибируют сборку микротрубочек. Анализ молекулярного моделирования синтезированных производных акридин-8-онов в области связывания колхицина показал, что каркас акридинона демонстрирует высокую структурную комплементарность к гидрофобному карману тубулина, формируя стабильные связи с ключевыми аминокислотными остатками Cysβ241, Leuβ248, Alaβ250, Leuβ255 и Asnβ258. Из-за возникающих стерических затруднений молекула акридин-8-онов мешает тубулину принять правильную конформацию, что нарушает процесс полимеризации микротрубочек. Блокада их функций приводит к нарушению формирования митотического веретена, остановке клеточного цикла в фазе G2/M и запускает апоптоз [12].

Изучение экспрессии генов и белков АТФ-транспортеров (в том числе с помощью молекулярного докинга) в клетках колоректального рака человека COLO 205 и COLO 320 под действием синтетического халкона на основе акридина 1С показало, что соединение 1C избирательно подавляет рост раковых клеток и значительно снижает уровень белка ABCB1, действуя как аллостерический модулятор этого белка [13].

При изучении способности ряда 3,9-дизамещенных акридинов ингибировать топоизомеразы обнаружено, что угнетающее действие этих производных снижается по мере увеличения длины линкерной цепи между акридином и бензольным кольцом. В то же время отмечено, что наличие заместителя в 4-м положении бензольного кольца (как в метильных, так и во фторсодержащих группах) не оказывает существенного влияния на активность этих структур по сравнению с соединением без заместителя в бензольном кольце [14].

В последние годы было сконструировано множество структурно разнообразных гибридных молекул в 9-м положении акридинового скелета для повышения противоопухолевой активности. Примерами таких соединений служат конъюгаты акридина с микофеноловой кислотой, тиазолидиндионом или хлорметином. Ряд производных акридина–триазола и акридина–тиадиазола продемонстрировали высокую цитотоксическую активность (по сравнению с 5-фторурацилом и цисплатином) в отношении клеток рака желудка человека MGC-803, гепатоцеллюлярной карциномы BEL-7404, крупноклеточного рака легкого NCI-H460 и клеток рака мочевого пузыря T24. Высокая цитотоксичность данных гибридных соединений обусловлена их способностью эффективно ингибировать топоизомеразу I в микромолярных концентрациях (у самого эффективного производного значение IC₅₀ составило 4,21 мкМ) [15].

В работе [16] изучено влияние химической структуры на биологическую активность соединений на основе тиазолидин-2,4-диона, акридинового фрагмента и ацетамидного линкера. Соединения, содержащие такие заместители, как 3,4,5-триметоксигруппа, 4-нитрогруппа и 2-трифторметильная группа, а также фрагмент акридин-9-ила, характеризовались более низкими значениями IC₅₀, что свидетельствует об их более высокой активности. Некоторые соединения продемонстрировали исключительную селективность в отношении к клеточной линии HeLa и высокую активность против линии раковых клеток HCT116, другие были эффективны в отношении клеток PATU поджелудочной железы.

Результаты представленных выше исследований указывают на огромный потенциал акридинов и их производных в качестве противоопухолевых агентов, поэтому синтез и изучение данных соединений осуществляют как зарубежные, так и российские ученые.

Так, научной группой Пермского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН под руководством профессора Ю.В. Шкляева были получены несколько потенциальных пирроло[3,2-l]акридинонов, в том числе Mob-155 S (рис. 1), на основе которого была предложена липосомальная лекарственная форма.

Рис. 1. Структурная формула субстанции под шифром Mob-155 S

Цель исследования — разработка липосом на основе производного пирроло[3,2-l]акридинона Mob-155 S и оценка их противоопухолевой активности в отношении лейкоза.

Материалы и методы

Синтез липосом. Для получения липосом использовали следующие реактивы: яичный фосфатидилхолин E PC S (96%), MPEG-2000-DSPE (оба производства Lipoid, Германия), холестерин с чистотой ≥99% (Sigma-Aldrich, Япония). В качестве растворителей применяли 96% этиловый спирт (ООО «Константа-Фарм М», Россия) и хлороформ («ХимМед», Россия); в качестве криопротекторов использовали лактозу, маннозу и сахарозу («ХимМед», Россия). Липосомы получали по традиционной технологии [17] в два этапа: 1-й этап — испарение органических растворителей и смыв полученной пленки водой; 2-й этап — экструдирование [18] липосомальной дисперсии путем последовательного продавливания через нейлоновые фильтры с различным диаметром пор (1,2; 0,45 и 0,22 мкм; ООО «Палл Евразия», Россия).

Образцы объемом 5 мл разливали во флаконы вместимостью 20 мл и лиофилизировали с помощью лабораторной сублимационной установки Edwards Minifast DO.2 (Ero Electronic S.p.A., Италия).

Характеристика липосом. Средний размер липосом и индекс полидисперсности (PDI) в образцах определяли методом динамического рассеяния света [19] с применением He–Ne-лазера (длина волны 633 нм) при угле рассеяния 173°; дзета-потенциал устанавливали электрофоретическим методом. Измерения проводили на анализаторе Zetasizer Nano-ZS 3600 (Malvern, Великобритания) с использованием стандартных протоколов исследования [20, 21].

Концентрацию Mob-155 S определяли спектрофотометрически при длине волны 307±3 нм.

Исследование цитотоксической активности in vitro. Цитотоксическую активность изучали на модели Т-клеточного лимфобластного лейкоза Jurkat, полученной из Банка клеточных линий Национального медицинского исследовательского центра онкологии им. Н.Н. Блохина в соответствии с процедурами Международного стандарта ISO 10993-5:2009. Клеточные линии культивировали стандартным методом [22] в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ICN Biomedicals, США), 10 мМ HEPES (Sigma-Aldrich, Германия), 2 мМ L-глутамина (Sigma-Aldrich, Германия), 40 нг/мл гентамицина (ICN Biomedicals, США), аминокислоты, пируват натрия и раствор витаминов («ПанЭко», Россия), при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры через 3–4 дня [23]. МТТ-тест проводили по стандартной методике. Клетки Jurkat инкубировали с исследуемыми липосомальными формами в различных концентрациях в течение 72 ч. По истечении этого времени в каждую лунку добавляли раствор МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид) до конечной концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали клетки с красителем еще в течение 4 ч при температуре 37°C. После растворения образовавшихся кристаллов формазана в диметилсульфоксиде измеряли оптическую плотность растворов на планшетном спектрофотометре Multiscan EX (Thermo Labsystems, Германия) при длине волны 540 нм. Жизнеспособность клеток рассчитывали как процентное отношение оптической плотности в опытных лунках к оптической плотности в лунках интактного контроля.

Статистическая обработка. Анализ полученных результатов выполняли с использованием пакетов программ Microsoft Excel и GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., США). Все эксперименты проводили в трехкратной независимой повторности. Результаты представляли как среднее значение ± стандартное отклонение. Проверку характера распределения данных осуществляли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Равенство дисперсий оценивали по критерию Левена. Для оценки статистической значимости различий между несколькими группами применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующими множественными сравнениями по критерию Тьюки. Критический уровень значимости принимали равным p<0,05.

Результаты

Изучение стабильности липосом в процессе хранения. В ходе первоначальных исследований был отобран состав с соотношением липидных компонентов E PC S/MPEG-2000-DSPE/холестерин 72,0:7,2:1,0 соответственно и концентрацией Mob-155 S, равной 0,5 мг/мл [24]. Мониторинг стабильности образцов осуществляли в течение 6 нед при двух температурных режимах — 6–8 и 21–23°C (рис. 2). Через 3 нед хранения при 6–8°C концентрация Mob-155 S в липосомальной дисперсии снизилась на 5,9% (p>0,05); средний заряд липосом изменился незначительно — с −17,7 до −19,8 (p>0,05); размер частиц варьировал в пределах 5%. Через 6 нед наиболее выраженным изменением было дальнейшее снижении концентрации Mob-155 S. При комнатной температуре (21–23°C) липосомы резко изменяли свои характеристики: заряд варьировал в диапазоне от −7,4 до −29,6; размер частиц увеличился на 47%, а концентрация Mob-155 S снизилась до 0,3 мг/мл (p<0,01).

Рис. 2. Мониторинг стабильности липосом Mob-155 S при выдерживании при двух температурных режимах. На графиках представлены средние значения трех независимых измерений. PDI — индекс полидисперсности

Таким образом, образцы при комнатной температуре были менее стабильны, что, скорее всего, связано с увеличением константы скорости гидролиза при повышенных температурах [25]. Межгрупповые различия между двумя температурными режимами становились статистически значимыми к 40-м суткам эксперимента (p<0,05). Постепенное изменение основных показателей качества в процессе хранения указывает на ограниченную стабильность липосом и на необходимость проведения их стабилизации. Помимо вспомогательных веществ, защищающих липосомы от окисления или сливания, лиофилизация является привлекательным способом увеличения срока годности и упрощения условий хранения в цепочке поставок [26].

Влияние криопротекторов на характеристики липосом. Для стабилизации липосом проводили лиофилизацию. Исследовали влияние криопротекторов на основные характеристики липосом. В качестве криопротекторов использовали три вида сахаридов (лактозу, маннозу и сахарозу) в двух концентрациях (5 и 10%) в липосомальной дисперсии. Контролем выступали исходные показатели качества липосом до добавления криопротектора (первоначальную концентрацию Mob-155 S принимали за 100%, размер частиц составлял 194 нм, дзета-потенциал — −20,5, PDI — 0,21).

При оценке полученных данных (рис. 3) видно, что в образцах с сахарами в концентрации 5% и лактозой в концентрации 10% средний размер липосом увеличился в 1,3–2,3 раза (p<0,01), полидисперсность возросла в 1,9–3,4 раза, а снижение концентрации Mob-155 S достигло 12% (p<0,05). Показатели качества липосом при введении в состав 10% сахарозы и 10% маннозы были близки, однако в образцах с сахарозой наблюдалось статистически значимое возрастание полидисперсности (p<0,05). В связи с этим манноза является предпочтительным криопротектором.

Рис. 3. Влияние криопротектора на физические характеристики липосом и на концентрацию действующего вещества после лиофилизации. На графиках представлены средние значения трех независимых измерений. PDI — индекс полидисперсности, Л — лактоза, М — манноза, С — сахароза

Цитотоксическая активность липосом. Для оценки противоопухолевого потенциала исследовали цитотоксическую активность липосом invitro на клеточной линии лимфобластного лейкоза Jurkat в сравнении с нативной субстанцией Mob-155 S и с незагруженными («пустыми») липосомами, не содержащими действующего вещества (рис. 4).

Рис. 4. Цитотоксическая активность липосом на модели лимфобластного лейкоза Jurkat

«Пустые» липосомы не оказывали антипролиферативного эффекта, а нативная субстанция и липосомы Mob-155 S уже в низких концентрациях демонстрировали высокую цитотоксическую активность по сравнению с незагруженными липосомами (p<0,001). Так, в концентрации 1,4 мкг/мл ингибирование роста клеток составляло 48±5 и 38±5% для нативной субстанции и липосом Mob-155 S соответственно, а в концентрации 2,8 мкг/мл количество живых клеток насчитывало 28±5 и 20±2% соответственно. Статистически значимых различий между липосомами Mob-155 S и нативной субстанцией не обнаружено (p>0,05).

Обсуждение

Акридиновая каркасная структура широко изучается как потенциальная основа для создания новых противоопухолевых препаратов. 9-аминоакридин и его производные являются слабыми основаниями и имеют значение pK_a около 9,9; они плохо растворимы в воде и растворимы в спиртах [11, 27, 28]. Анализ структуры исследуемого соединения (см. рис. 1) показал, что наличие нитрогруппы снижает основность атома азота, несмотря на слабые электронодонорные свойства дополнительного алкильного заместителя. В связи с этим показатель pK_a для данного соединения должен быть ближе к 7,0–8,0. Однако это не оказывает существенного влияния на растворимость соединения. Как и другие аминоакридины, Mob-155 S не растворим в воде, ограниченно растворим в хлороформе и ацетоне и растворим в спирте. С учетом данного факта в качестве лекарственной формы для этого соединения были выбраны липосомы.

Ряд физико-химических параметров критически влияет на текучесть мембраны липосом и, следовательно, на их физическую стабильность. К таким параметрам относятся температура, pH, ионная сила, состав фосфолипидов и наличие стабилизирующих агентов в липидном бислое. Кроме того, такие факторы, как размер везикул, поверхностный заряд, определяют целостность мембраны, общую прочность формулы, эффективность клеточного поглощения и взаимодействия с биологическими системами [28]. Сами липосомы склонны к окислению и гидролизу во время хранения [29].

Размер и заряд липосом влияют не только на их стабильность в кровотоке, но и на способность накапливаться в целевых участках. При этом крупные частицы быстрее распознаются и очищаются клетками ретикулоэндотелиальной системы [30]. Сразу после получения и в течение непродолжительного хранения липосомы Mob-155 S имели размеры частиц около 200 нм. Через 40 дней хранения при температуре 21–23°C отмечали снижение концентрации Mob-155 S, увеличение среднего размера частиц до 300–320 нм и индекса PDI до 0,45–0,55. При этом в процессе мониторинга фиксировали не только изменения в основных характеристиках липосом, но и значительные внешние проявления: загустевание и образование небольшого осадка. Данные проявления связаны с тем, что липосомы, микро- и наночастицы из-за присущей им нестабильности склонны к агрегации и седиментации. Однако их можно эффективно стабилизировать с помощью сублимационной сушки [31].

Лиофилизация может влиять на содержание действующего вещества и распределение частиц по размерам, а также приводить к образованию пригодного для использования осадка с коротким временем восстановления. Чтобы защитить соединения от возможных изменений, вызванных процессом обезвоживания, рекомендуется добавлять вспомогательные вещества, которые защищают их при лиофилизации [32]. Поскольку короткоцепочечные сахариды способны защищать мембраны, они являются предпочтительными вспомогательными молекулами, которые помогают минимизировать нестабильность липидных и полимерных наночастиц на этапе замораживания. Они замещают связанную воду вокруг липосом и образуют вязкую матрицу, которая снижает их подвижность в процессе заморозки [33].

В процессе лиофилизации мы оценили действие трех сахаридов в двух концентрациях на основные качественные и количественных характеристики липосом. Все высушенные образцы липосом, независимо от криопротектора, легко ресуспендировались. Однако необходимый протективный эффект, проявляющийся в сохранении концентрации действующего вещества и остальных характеристик, наблюдался только под действием 10% маннозы. Полученные результаты согласуются с литературными данными [34], в соответствии с которыми степень стабилизации, обеспечиваемая сахаридами, часто зависит от их концентрации. Причем для липосом требуется значительное количество криопротекторов, чтобы пересытить поверхность и привести к образованию стекловидной матрицы вокруг их структуры [35].

В ряде научных исследований сообщается об антипролиферативной активности производных акридина [36, 37]. Так, производное пирроло[3,2-l]акридинона при скрининговых исследованиях продемонстрировало высокую активность в отношении клеток лимфобластного лейкоза Jurkat (показатель IC₅₀ составлял 29,6 мкМ) [38]. В работе [39] несколько аналогов 1-нитроакридина/4-метил-1-нитроакридина и 4-нитроакридона, связанных с пептидами тафтсина/ретро-тафтсина, также были активны в отношении клеток Jurkat. Согласно результатам молекулярного докинга, наблюдаемый биологический эффект обусловлен не только связыванием с рецептором эпидермального фактора роста, но и ингибированием протоонкогенной тирозинкиназы Src [39]. Тиазакридины подавляли рост неопластических клеток Raji и Jurkat; значения IC₅₀ для соединения LPSF/AC-119 составили 0,6 и 1,53 мкM соответственно [40].

МТТ-анализ на модели клеток лимфобластного лейкоза Jurkat продемонстрировал высокий потенциал липосом Mob-155 S в качестве нового противоопухолевого агента. Близкие значения показателя IC₅₀ для нативной субстанции (1,76±0,20 мкг/мл) и для липосом на основе Mob-155 S (1,46±0,10 мкг/мл) свидетельствуют о сохранении противоопухолевой активности действующего вещества после его включения в лекарственную форму, а также о безопасности вспомогательных веществ.

Для более полной характеристики липосом запланированы исследования по изучению кинетики высвобождения Mob-155 S в различных средах, расширенные цитотоксические исследования на панели различных опухолевых моделей, а также разработка методов идентификации Mob-155 S в биологических жидкостях.

Заключение

Разработаны липосомы с производным пирроло[3,2-l]акридинона Mob-155 S, которые характеризуются однородным размером частиц, хорошей регидратируемостью после лиофилизации и антипролиферативной активностью в отношении клеток лейкоза.

Финансирование исследования и конфликт интересов отсутствуют.