Использование состава на основе коллагена высокой концентрации и желатиновых гранул в качестве биочернил для экструзионной 3D-биопечати пористо-структурированных гидрогелевых конструкций

Цель исследования — анализ пригодности состава биочернил на основе коллагена высокой концентрации (40 мг/мл) и желатиновых гранул (6,25 мг/мл) для печати пористо-структурированных гидрогелевых конструкций с помощью экструзионного 3D-биопринтера.

Материалы и методы. Биопечать проводили на биопринтере 3D Invivo (Rokit, Южная Корея). Оценивали непрерывность филамента при экструзии, изменение его толщины после тестовой печати и инкубирования, а также биодеградацию готовых скаффолдов. Исследовали цитосовместимость гидрогеля по пролиферации инкорпорированных в скаффолды мультипотентных мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека (ММСК-ЖТ). Для определения иммунофенотипа ММСК-ЖТ проводили проточную цитометрию. Пролиферацию клеток in vitro в структуре скаффолдов исследовали спектрофотометрически после добавления реагента PrestoBlue в течение 28 сут. Анализ экспрессии целевых генов осуществляли методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией на 21-е сутки культивирования. В работе использовали праймеры к матричной РНК, кодирующей синтез хондрогенных факторов и метаболитов (ACAN, SOX9, COL1A1, COL2A1), поверхностных маркеров (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105), а также факторов гипоксии (HIF1A), пролиферации (PCNA) и апоптоза (BCL2, BAX). Морфологию скаффолдов изучали на 28-е сутки культивирования посредством световой микроскопии после фиксации и окраски гистологических срезов.

Результаты. Экструзия гидрогелевого состава на основе коллагена высокой концентрации (40 мг/мл) и желатиновых гранул (6,25 мг/мл) в процессе печати была стабильной, без обрыва филамента. При инкубации в фосфатно-солевом буфере толщина филамента данного гидрогеля была статистически значимо выше толщины скаффолда после печати. Деградация скаффолдов из коллагена и желатина в растворе коллагеназы I типа начиналась раньше, чем коллагеновых. Инкубация в фосфатно-солевом буфере в течение 14 сут приводила к меньшей потере массы при сушке скаффолдов из коллагена с гранулами желатина. Клетки, выделенные из жировой ткани человека, экспрессировали поверхностные маркеры, характерные для ММСК-ЖТ. Пролиферацию и дифференцировку ММСК-ЖТ в хондрогенном направлении наблюдали в обеих сравниваемых группах. Различия заключались в пространственном расположении клеток. В скаффолдах из коллагена большая часть клеток находилась на поверхности, а в скаффолдах из коллагена и желатина клетки были распределены по всему объему. Результаты количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией по методу 2^–ΔΔCt продемонстрировали повышенную экспрессию транскрипционного фактора SOX9 клетками в скаффолдах из коллагена и желатина, а также пониженную экспрессию антиапоптотического гена BCL2 относительно скаффолдов из коллагена.

Заключение. В работе предложен состав биочернил на основе коллагена высокой концентрации (40 мг/мл) и желатиновых гранул (6,25 мг/мл) для биопечати пористо-структурированных гидрогелевых конструкций. Исследование показало, что гидрогель пригоден для печати и проявляет свойства пористого материала. Гидрогель обеспечивал равномерное распределение ММСК-ЖТ в объеме скаффолда и способствовал их дифференцировке в хондрогенном направлении. Таким образом, предлагаемый состав биочернил является перспективным материалом для применения в тканевой инженерии.

1. Lories R.J., Luyten F.P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol 2011; 7(1): 43–49, https://doi.org/10.1038/nrrheum.2010.197.
2. Matai I., Kaur G., Seyedsalehi A., McClinton A., Laurencin C.T. Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering. Biomaterials 2020; 226: 119536, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2019.119536.
3. Le H., Xu W., Zhuang X., Chang F., Wang Y., Ding J. Mesenchymal stem cells for cartilage regeneration. J Tissue Eng 2020; 11: 2041731420943839, https://doi.org/10.1177/2041731420943839.
4. Tang X., Daneshmandi L., Awale G., Nair L.S., Laurencin C.T. Skeletal muscle regenerative engineering. Regen Eng Transl Med 2019; 5(3): 233–251, https://doi.org/10.1007/s40883-019-00102-9.
5. Choudhury D., Anand S., Naing M.W. The arrival of commercial bioprinters — towards 3D bioprinting revolution! Int J Bioprint 2018; 4(2): 139, https://doi.org/10.18063/IJB.v4i2.139.
6. Atala A., Yoo J.J. Essentials of 3D biofabrication and translation. 1st edition. Academic Press; 2015.
7. Malda J., Visser J., Melchels F.P., Jüngst T., Hennink W.E., Dhert W.J., Groll J., Hutmacher D.W. 25th anniversary article: engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater 2013; 25(36): 5011–5028, https://doi.org/10.1002/adma.201302042.
8. Ahn S.H., Lee J., Park S.A., Kim W.D. Three-dimensional bio-printing equipment technologies for tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng Regen Med 2016; 13(6): 663–676, https://doi.org/10.1007/s13770-016-0148-1.
9. Isaeva E.V., Kisel A.A., Beketov E.E., Demyashkin G.A., Yakovleva N.D., Lagoda T.S., Arguchinskaya N.V., Baranovsky D.S., Ivanov S.A., Shegay P.V., Kaprin A.D. Effect of collagen and GelMA on preservation of the costal chondrocytes’ phenotype in a scaffold in vivo. Sovremennye tehnologii v medicine 2023; 15(2): 5, https://doi.org/10.17691/stm2023.15.2.01.
10. Gosset M., Berenbaum F., Thirion S., Jacques C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc 2008; 3(8): 1253–1260, https://doi.org/10.1038/nprot.2008.95.
11. Verbruggen G., Wang J., Wang L., Elewaut D., Veys E.M. Analysis of chondrocyte functional markers and pericellular matrix components by flow cytometry. Methods Mol Med 2004; 100: 183–208, https://doi.org/10.1385/1-59259-810-2:183.
12. Mumme M., Barbero A., Miot S., Wixmerten A., Feliciano S., Wolf F., Asnaghi A.M., Baumhoer D., Bieri O., Kretzschmar M., Pagenstert G., Haug M., Schaefer D.J., Martin I., Jakob M. Nasal chondrocyte-based engineered autologous cartilage tissue for repair of articular cartilage defects: an observational first-in-human trial. Lancet 2016; 388(10055): 1985–1994, https://doi.org/10.1016/S0140-6736(16)31658-0.
13. Hellingman C.A., Verwiel E.T., Slagt I., Koevoet W., Poublon R.M., Nolst-Trenité G.J., Baatenburg de Jong R.J., Jahr H., van Osch G.J. Differences in cartilage-forming capacity of expanded human chondrocytes from ear and nose and their gene expression profiles. Cell Transplant 2011; 20(6): 925–940, https://doi.org/10.3727/096368910X539119.
14. Айзенштадт А.А., Енукашвили Н.И., Золина Т.Л., Александрова Л.В., Смолянинов А.Б. Сравнение пролиферативной активности и фенотипа МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика. Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова 2015; 7(2): 14–22.
15. Logovskaya L.V., Bukharova T.B., Volkov A.V., Vikhrova E.B., Makhnach O.V., Goldshtein D.V. Induction of osteogenic differentiation of multipotent mesenchymal stromal cells from human adipose tissue. Bull Exp Biol Med 2013; 155(1): 145–150, https://doi.org/10.1007/s10517-013-2100-x.
16. Hospodiuk M., Dey M., Sosnoski D., Ozbolat I.T. The bioink: a comprehensive review on bioprintable materials. Biotechnol Adv 2017; 35(2): 217–239, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2016.12.006.
17. Osidak E.O., Karalkin P.A., Osidak M.S., Parfenov V.A., Sivogrivov D.E., Pereira F.D.A.S., Gryadunova A.A., Koudan E.V., Khesuani Y.D., Кasyanov V.A., Belousov S.I., Krasheninnikov S.V., Grigoriev T.E., Chvalun S.N., Bulanova E.A., Mironov V.A., Domogatsky S.P. Viscoll collagen solution as a novel bioink for direct 3D bioprinting. J Mater Sci Mater Med 2019; 30(3): 31, https://doi.org/10.1007/s10856-019-6233-y.
18. Isaeva E.V., Beketov E.E., Demyashkin G.A., Yakovleva N.D., Arguchinskaya N.V., Kisel A.A., Lagoda T.S., Malakhov E.P., Smirnova A.N., Petriev V.M., Eremin P.S., Osidak E.O., Domogatsky S.P., Ivanov S.A., Shegay P.V., Kaprin A.D. Cartilage formation in vivo using high concentration collagen-based Bioink with MSC and decellularized ECM granules. Int J Mol Sci 2022; 23(5): 2703, https://doi.org/10.3390/ijms23052703.
19. Arguchinskaya N.V., Beketov E.E., Isaeva E.V., Kisel A.A., Eremin P.S., Ivanov S.A., Shegay P.V., Kaprin A.D. Riboflavin-induced photocrosslinking of highly concentrated collagen: printing accuracy, degradation time, and cytocompatibility. Appl Biochem Microbiol 2023; 59(8): 1062–1070, https://doi.org/10.1134/s0003683823080033.
20. Primer-BLAST. A tool for finding specific primers. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi.
21. Xie F., Xiao P., Chen D., Xu L., Zhang B. miRDeepFinder: a miRNA analysis tool for deep sequencing of plant small RNAs. Plant Mol Biol 2012; 80(1): 75–84, https://doi.org/10.1007/s11103-012-9885-2.
22. Radisic M., Deen W., Langer R., Vunjak-Novakovic G. Mathematical model of oxygen distribution in engineered cardiac tissue with parallel channel array perfused with culture medium containing oxygen carriers. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005; 288(3): H1278–H1289, https://doi.org/10.1152/ajpheart.00787.2004.
23. Xin S., Chimene D., Garza J.E., Gaharwar A.K., Alge D.L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomater Sci 2019; 7(3): 1179–1187, https://doi.org/10.1039/c8bm01286e.
24. Ying G.L., Jiang N., Maharjan S., Yin Y.X., Chai R.R., Cao X., Yang J.Z., Miri A.K., Hassan S., Zhang Y.S. Aqueous two-phase emulsion Bioink-enabled 3D bioprinting of porous hydrogels. Adv Mater 2018; 30(50): e1805460, https://doi.org/10.1002/adma.201805460.
25. Tao J., Zhu S., Zhou N., Wang Y., Wan H., Zhang L., Tang Y., Pan Y., Yang Y., Zhang J., Liu R. Nanoparticle-stabilized emulsion Bioink for digital light processing based 3D bioprinting of porous tissue constructs. Adv Healthc Mater 2022; 11(12): e2102810, https://doi.org/10.1002/adhm.202102810.
26. Kim M.K., Jeong W., Lee S.M., Kim J.B., Jin S., Kang H.W. Decellularized extracellular matrix-based bio-ink with enhanced 3D printability and mechanical properties. Biofabrication 2020; 12(2): 025003, https://doi.org/10.1088/1758-5090/ab5d80.
27. Liu H.W., Su W.T., Liu C.Y., Huang C.C. Highly organized porous gelatin-based scaffold by microfluidic 3D-foaming technology and dynamic culture for cartilage tissue engineering. Int J Mol Sci 2022; 23(15): 8449, https://doi.org/10.3390/ijms23158449.
28. Isaeva E.V., Beketov E.E., Yuzhakov V.V., Arguchinskaya N.V., Kisel A.A., Malakhov E.P., Lagoda T.S., Yakovleva N.D., Shegay P.V., Ivanov S.A., Kaprin A.D. The use of collagen with high concentration in cartilage tissue engineering by means of 3D-bioprinting. Cell and Tissue Biology 2021; 15(5): 493–502, https://doi.org/10.1134/s1990519x21050059.
29. Tabatabaei F., Moharamzadeh K., Tayebi L. Fibroblast encapsulation in gelatin methacryloyl (GelMA) versus collagen hydrogel as substrates for oral mucosa tissue engineering. J Oral Biol Craniofac Res 2020; 10(4): 573–577, https://doi.org/10.1016/j.jobcr.2020.08.015.
30. Krouwels A., Melchels F.P.W., van Rijen M.H.P., Öner F.C., Dhert W.J.A., Tryfonidou M.A., Creemers L.B. Comparing hydrogels for human nucleus pulposus regeneration: role of osmolarity during expansion. Tissue Eng Part C Methods 2018; 24(4): 222–232, https://doi.org/10.1089/ten.TEC.2017.0226.
31. Ma X., Yu C., Wang P., Xu W., Wan X., Lai C.S.E., Liu J., Koroleva-Maharajh A., Chen S. Rapid 3D bioprinting of decellularized extracellular matrix with regionally varied mechanical properties and biomimetic microarchitecture. Biomaterials 2018; 185: 310–321, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2018.09.026.
32. Shirasawa S., Sekiya I., Sakaguchi Y., Yagishita K., Ichinose S., Muneta T. In vitro chondrogenesis of human synovium-derived mesenchymal stem cells: optimal condition and comparison with bone marrow-derived cells. J Cell Biochem 2006; 97(1): 84–97, https://doi.org/10.1002/jcb.20546.
33. Богдан В.Г., Зафранская М.М., Гаин Ю.М., Де­мидчик Ю.Е. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани и фибробласты — выбор клеточной составляющей для биологических трансплантатов. Гены и клетки 2012; 7(4): 48–54.
34. Ichinose S., Tagami M., Muneta T., Sekiya I. Morphological examination during in vitro cartilage formation by human mesenchymal stem cells. Cell Tissue Res 2005; 322(2): 217–226, https://doi.org/10.1007/s00441-005-1140-6.
35. Farrell M.J., Shin J.I., Smith L.J., Mauck R.L. Functional consequences of glucose and oxygen deprivation on engineered mesenchymal stem cell-based cartilage constructs. Osteoarthritis Cartilage 2015; 23(1): 134–142, https://doi.org/10.1016/j.joca.2014.09.012.
36. Shirasawa S., Sekiya I., Sakaguchi Y., Yagishita K., Ichinose S., Muneta T. In vitro chondrogenesis of human synovium-derived mesenchymal stem cells: optimal condition and comparison with bone marrow-derived cells. J Cell Biochem 2006; 97(1): 84–97, https://doi.org/10.1002/jcb.20546.
37. Kim J.H., Kim W.K., Sung Y.K., Kwack M.H., Song S.Y., Choi J.S., Park S.G., Yi T., Lee H.J., Kim D.D., Seo H.M., Song S.U., Sung J.H. The molecular mechanism underlying the proliferating and preconditioning effect of vitamin C on adipose-derived stem cells. Stem Cells Dev 2014; 23(12): 1364–1376, https://doi.org/10.1089/scd.2013.0460.
38. Barlian A., Judawisastra H., Alfarafisa N.M., Wibowo U.A., Rosadi I. Chondrogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells induced by L-ascorbic acid and platelet rich plasma on silk fibroin scaffold. PeerJ 2018; 6: e5809, https://doi.org/10.7717/peerj.5809.
39. Brown D.A., MacLellan W.R., Laks H., Dunn J.C., Wu B.M., Beygui R.E. Analysis of oxygen transport in a diffusion-limited model of engineered heart tissue. Biotechnol Bioeng 2007; 97(4): 962–975, https://doi.org/10.1002/bit.21295.
40. Hussey G.S., Dziki J.L., Badylak S.F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nat Rev Mater 2018; 3(7): 159–173, https://doi.org/10.1038/s41578-018-0023-x.
41. Ibragimova S.I., Medvedeva E.V., Romanova I.A., Istranov L.P., Istranova E.V., Lychagin A.V., Nedorubov A.A., Timashev P.S., Telpukhov V.I., Chagin A.S. Implantation of various cell-free matrixes does not contribute to the restoration of hyaline cartilage within full-thickness focal defects. Int J Mol Sci 2021; 23(1): 292, https://doi.org/10.3390/ijms23010292.
42. Dionigi B., Ahmed A., Pennington E.C., Zurakowski D., Fauza D.O. A comparative analysis of human mesenchymal stem cell response to hypoxia in vitro: implications to translational strategies. J Pediatr Surg 2014; 49(6): 915–918, https://doi.org/10.1016/j.jpedsurg.2014.01.023.
43. Jeon B.G., Kwack D.O., Rho G.J. Variation of telomerase activity and morphology in porcine mesenchymal stem cells and fibroblasts during prolonged in vitro culture. Anim Biotechnol 2011; 22(4): 197–210, https://doi.org/10.1080/10495398.2011.624651.
44. Dmitrieva R.I., Minullina I.R., Bilibina A.A., Tarasova O.V., Anisimov S.V., Zaritskey A.Y. Bone marrow- and subcutaneous adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: differences and similarities. Cell Cycle 2012; 11(2): 377–383, https://doi.org/10.4161/cc.11.2.18858.
45. Russell A.L., Lefavor R., Durand N., Glover L., Zubair A.C. Modifiers of mesenchymal stem cell quantity and quality. Transfusion 2018; 58(6): 1434–1440, https://doi.org/10.1111/trf.14597.
46. Diaz-Romero J., Gaillard J.P., Grogan S.P., Nesic D., Trub T., Mainil-Varlet P. Immunophenotypic analysis of human articular chondrocytes: changes in surface markers associated with cell expansion in monolayer culture. J Cell Physiol 2005; 202(3): 731–742, https://doi.org/10.1002/jcp.20164.
47. Albrecht C., Schlegel W., Bartko P., Eckl P., Jagersberger T., Vécsei V., Marlovits S. Changes in the endogenous BMP expression during redifferentiation of chondrocytes in 3D cultures. Int J Mol Med 2010; 26(3): 317–323, https://doi.org/10.3892/ijmm_00000468.
48. Maldonado V.V., Patel N.H., Smith E.E., Barnes C.L., Gustafson M.P., Rao R.R., Samsonraj R.M. Clinical utility of mesenchymal stem/stromal cells in regenerative medicine and cellular therapy. J Biol Eng 2023; 17(1): 44, https://doi.org/10.1186/s13036-023-00361-9.
49. Cicione C., Díaz-Prado S., Muiños-López E., Hermida-Gómez T., Blanco F.J. Molecular profile and cellular characterization of human bone marrow mesenchymal stem cells: donor influence on chondrogenesis. Differentiation 2010; 80(2–3): 155–165, https://doi.org/10.1016/j.diff.2010.06.001.
50. Fernandes T.L., Kimura H.A., Pinheiro C.C.G., Shimomura K., Nakamura N., Ferreira J.R., Gomoll A.H., Hernandez A.J., Bueno D.F. Human synovial mesenchymal stem cells good manufacturing practices for articular cartilage regeneration. Tissue Eng Part C Methods 2018; 24(12): 709–716, https://doi.org/10.1089/ten.TEC.2018.0219.
51. Chang C.B., Han S.A., Kim E.M., Lee S., Seong S.C., Lee M.C. Chondrogenic potentials of human synovium-derived cells sorted by specific surface markers. Osteoarthritis Cartilage 2013; 21(1): 190–199, https://doi.org/10.1016/j.joca.2012.10.005.
52. Raftery R.M., Gonzalez Vazquez A.G., Chen G., O’Brien F.J. Activation of the SOX-5, SOX-6, and SOX-9 trio of transcription factors using a gene-activated scaffold stimulates mesenchymal stromal cell chondrogenesis and inhibits endochondral ossification. Adv Healthc Mater 2020; 9(10): e1901827, https://doi.org/10.1002/adhm.201901827.
53. Lefebvre V., Angelozzi M., Haseeb A. SOX9 in cartilage development and disease. Curr Opin Cell Biol 2019; 61: 39–47, https://doi.org/10.1016/j.ceb.2019.07.008.
54. Song H., Park K.H. Regulation and function of SOX9 during cartilage development and regeneration. Semin Cancer Biol 2020; 67(Pt 1): 12–23, https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2020.04.008.
55. King L.E., Hohorst L., García-Sáez A.J. Expanding roles of BCL-2 proteins in apoptosis execution and beyond. J Cell Sci 2023; 136(22): jcs260790, https://doi.org/10.1242/jcs.260790.
56. Wang Q., Zhang L., Yuan X., Ou Y., Zhu X., Cheng Z., Zhang P., Wu X., Meng Y., Zhang L. The relationship between the Bcl-2/Bax proteins and the mitochondria-mediated apoptosis pathway in the differentiation of adipose-derived stromal cells into neurons. PLoS One 2016; 11(10): e0163327, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0163327.
57. Yuan X., Zhang L., Wang S., Ou Y., Wang Q., Peng W., Luo H., Cheng Z., Zhu X. Mitochondrial apoptosis and autophagy in the process of adipose-derived stromal cell differentiation into astrocytes. Cell Biol Int 2016; 40(2): 156–165, https://doi.org/10.1002/cbin.10548.

Kisel A.A., Isaeva E.V., Beketov E.E., Arguchinskaya N.V., Gusarova V.R., Yakimova A.O., Demyashkin G.A., Lagoda T.S., Baranovsky D.S., Klabukov I.D., Ivanov S.A., Shegay P.V., Kaprin A.D. The Use of High-Concentration Collagen-Based Composition and Gelatin Granules as Bioinks for Extrusion 3D Bioprinting of Porous-Structured Hydrogel Constructs. Sovremennye tehnologii v medicine 2025; 17(5): 33, https://doi.org/10.17691/stm2025.17.5.02